Его интерес к физиологии возрос после прочтения книги И. Сеченова «Рефлексы головного мозга», но освоить этот предмет ему удалось, обучаясь в лаборатории И. Циона, изучавшего роль депрессорных нервов. Первое научное исследование Павлова — изучение секреторной иннервации поджелудочной железы. За него И. Павлов и М. Афанасьев были награждены золотой медалью университета.
В 1875 году И.П. Павлов получил звание кандидата естественных наук. В1883 году он защитил диссертацию на соискание степени доктора медицины, посвященную описанию нервов, контролирующих функции сердца. К 1890 году труды Павлова получили признание со стороны ученых всего мира. С 1891 года он заведовал физиологическим отделом Института экспериментальной медицины, организованного при его участии; одновременно он оставался руководителем физиологических исследований в Военно-медицинской академии, в которой проработал с 1895 по 1925 год.
В 1904 году Павлов был награжден Нобелевской премией по физиологии и медицине «за работу по физиологии пищеварения, благодаря которой было сформировано более ясное понимание жизненно важных аспектов этого вопроса».
В институте, который располагался неподалеку от Петербурга, в местечке Колтуши, Павлов создал единственную в мире лабораторию по изучению высшей нервной деятельности. Ее центром была знаменитая «Башня молчания» — особое помещение, которое позволяло поместить подопытное животное в полную изоляцию от внешнего мира. Человек небольшого роста, худощавый, скромно, незаметно одетый, припадающий на одну ногу, но с выправкой офицера, левша, необычайно быстрый даже в старости, живой, но без старческой мелкой суетливости, с лицом то серьезным, то насмешливым, но никогда бесстрастным — вот портрет-схема хозяина Колтушей. Американский врач Джон Келлог, вспоминая выступление Павлова в Баттл-Крине в 1923 году, писал: «Когда Павлов говорит, то не только голосом, но и мимикой стремится выразить свои мысли. Глаза его горят, мускулы лица непрестанно играют, изменяя ежесекундно выражение лица. Если бы он не был ведущим физиологом мира, он легко мог бы быть величайшим драматическим актером».